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Aide aux choix d'un Microscope

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"Quel microscope offrir Ă  un enfant ?"

SOMMAIRE



Les principes de la microscopie

Introduction

Les propriétés d'un faisceau de lumière émis par une source lumineuse naturelle ou artificielle sont modifiées lorsqu'il traverse un échantillon. Ces modifications contiennent des informations spécifiques et caractéristiques de l’échantillon. Les lentilles des objectifs intégrées au microscope permettent l'amplification et la transformation de ces informations en une image visible à l'oeil. Plusieurs paramètres, parmi lesquelles les propriétés des milieux traversés par la lumière et la qualité des lentilles, agissent alors et modifient la qualité de l’information que l’observateur va recevoir. Chaque fois que le rayon lumineux va changer de milieu ou traverser une lentille, il va subir des changements de direction, des pertes d’informations. La qualité de la source lumineuse et son origine sont également des paramètres importants en microscopie.


La lumière

Les longueurs d'ondes
Le spectre de la lumière visible

La lumière est un ensemble d’ondes électromagnétiques qui stimulent les cellules nerveuses (cônes et bâtonnets) de l’oeil. Notre oeil est plus sensible aux variations de la couleur qu’à celles de l’intensité.




Les sources de lumières

Les sources de lumière courrament utilisées en microscopie sont les suivantes : le soleil, les lampes à incandescence, les lampes à arc, les diodes électroluminescentes (LEDs) et le laser.

Le Soleil


  • - Notre rĂ©fĂ©rence naturelle
  • - TempĂ©rature de couleur 5300 °K
  • - Lumière filtrĂ©e par l’atmosphère terrestre
  • - Spectre visible bleutĂ©

Lampes Ă  incandescence


Les types de lampes pour microscope
Exemples de lampes Ă  incandescence
  • - Pour un usage gĂ©nĂ©ral
  • - Faible coĂ»t
  • - TempĂ©rature 3600 °K
  • - Le spectre visible dĂ©pend de la tension exercĂ©e aux bornes de la lampe.
  • - Faible intensitĂ© dans les couleurs froides

Lampes Ă  arc


lampes XENON et lampes MERCURE
Exemple de lampe Ă  arc
  • Usage :
  •   - Fluorescence (mercure)
  •   - MĂ©tallographie (xĂ©non)
  •   - Loupe binoculaire (nĂ©on)
  •  
  • Avantages :
  •   - IntensitĂ© constante
  •   - Forte concentration lumineuse
  •  
  • InconvĂ©nients :
  •   - DurĂ©e de vie limitĂ©e
  •   - Prix Ă©levĂ©

Diodes Ă©lectroluminescentes (LEDs)


Led diode Ă©lectroluminescente

Principalement employé pour l’éclairage sous objectif des stéréo microscopes

  • - Avantage : longue durĂ©e de vie (100.000 H contre 1.000 H pour une lampe classique)
  • - Faible consommation
  • - IntensitĂ© constante


Comparaison des différentes sources


Spectre des sources lumineuses

Comme on peut le constater sur le graphique de gauche, chaque source de lumière possède un spectre d'émission spécifique.

Cette donnée devra parfois être prise en compte lors du choix de la source lumineuse la plus adapté à l'application souhaitée. On peut ainsi constater qu’une lampe à incandescence donne une lumière jaune orangé alors que la LED tirera davantage vers le bleu.



Les Lentilles



Exemple de lentille simple

On appelle lentille tout milieu transparent limité par deux surfaces dont l’une au moins n’est pas plane. La lentille est définie géométriquement par les paramètres suivants : le rayon de courbure, l’axe principal, la section principale, le diamètre d’ouverture, la distance focale.


RĂ©fraction


Refraction de la lumière à travers le verre et l'eau

les lentilles transmettent la lumière par un phénomène appellé "réfraction" qui varie selon le milieu traversé et les différentes longueurs d'onde composant la lumière. Cela peut entrainer des distorsions plus ou moins grande au niveau de l'image transmise.


Les défauts les plus courants observés quand le rayon lumineux traverse une lentille :


Aberration chromatique
Aberration chromatique
Aberration sphérique
Aberration sphérique
Courbure du champs
Courbure du champs
Coma
Coma

Les différents types de microscopes

On distingue trois types de structures de microscopes :

  • 1. Les microscopes "Droits"
  • 2. Les microscopes "InversĂ©s"
  • 3. Les "StĂ©rĂ©o microscopes"

A cela s'ajoute deux type d'Ă©clairage :

  • A. L'Ă©clairage "diascopie" (par transmission)
  • B. L'Ă©clairage "Ă©piscopie" (par rĂ©flexion)


Il en découle différentes combinaisons suivant l'usage auquel le microscope est destiné :

  • Microscope droit en Biologie
  • - Transmission : fond clair, fond noir, contraste de phase, polarisation
  • - RĂ©flexion : Fluorescence
  •  
  • Microscope droit en Industrie
  • - Transmission : Fond clair, Polarisation
  • - RĂ©flexion : fond clair, fond noir, polarisation
  •  
  • Microscope InversĂ© Biologie
  • - Transmission : fond clair, contraste de phase
  • - RĂ©flexion : Fluorescence
  •  
  • Microscope inversĂ© MĂ©tallographie
  • - RĂ©flexion : fond clair fond noir InterfĂ©rentiel
  •  
  • StĂ©rĂ©o microscope
  • - Transmission : fond clair, polarisation
  • - RĂ©flexion : fond clair, polarisation


Choisir la bonne structure

Le choix ne se fera ni en fonction des optiques (la plupart des objectifs se montent indifféremment sur les microscopes droits et les microscopes inversés) ni en fonction du mode d’observation. Ce sera en général la nature des échantillons à observer qui déterminera la structure mécanique du microscope.


LE MICROSCOPE DROIT :

On choisira ce type de microscope pour observer des échantillons relativement minces (moins de 50 mm) ou pour ceux qui demandent des déplacements de la platine supérieurs à 30 mm.

trajet optique d'un microscope droit

LE MICROSCOPE INVERSE (platine fixe)

On choisira ce type de microscope pour observer des échantillons de volume important (métallographie) ou bien quand l’échantillon est dans un récipient avec du liquide (culture cellulaire)

trajet optique d'un microscope inversé

LE STEREO MICROSCOPE pour des faibles grossissements en stéréoscopie

Sur le plan économique, il faut également comprendre, qu’à équipement équivalent (même mode
d’observation et mêmes optiques) le microscope droit sera toujours plus économique à l’achat.

trajet optique d'un stéréo microscope

La terminologie

LE STATIF : C'est la pièce maîtresse, le support mécanique. Il supporte le système de mise au point et la platine il doit donc être d'une grande stabilité. De manière générale, il conditionne l'ergonomie générale de l'appareil.

LE BOITIER LAMPE : Il s'agit d'un sytème destiné à éclairer les échantillons à observer. Il doit être sécurisé tout en permettant un remplacement facile de la lampe. Il peut recevoir des lampes tungstène, halogène, xénon ou à vapeur de mercure.

LA PLATINE : C'est la partie qui va recevoir l'échantillon. Ses dimensions doivent être adaptées à celles des échantillons et elle doit être très résistante à l'abrasion. Sa mécanique doit être soignée et résistante car elle est toujours l'élément le plus sollicité du microscope. Elle peut être, parfois motorisée.

LA TOURELLE : Elle reçoit les objectifs. Sa capacité peut varier selon les modes d'observation. Dans certains cas elle peut être orientable et dans d'autres cas motorisée.

L'ILLUMINATEUR : Il permet d'amener la lumière sur l'échantillon et de réguler son intensité pour une observation dans les meilleures conditions possibles. Il comporte un ou deux diaphragmes.

LE CONDENSEUR : Comme l'illuminateur il sert à éclairer l'échantillon. Son rôle est de concentrer le flux lumineux. Son bon réglage est très important. Ses caractéristiques sont liées au mode d'observation (fond clair, fond noir, contraste de phase, etc....)

LE TUBE D'OBSERVATION : Fixe ou orientable, il est monoculaire, binoculaire ou trinoculaire (un oculaire par œil plus une troisième pour une camĂ©ra numĂ©rique). Il reçoit les oculaires et se caractĂ©rise par son indice de champ.

L'OBJECTIF : C'est l'élément le plus important pour le résultat final. Son rôle est de collecter un maximum de lumière à partir de l’objet et de former une image réelle de haute qualité. Il peut y avoir, de cinq à vingt lentilles dans un seul objectif. Son grossissement peut varier de 1,25 à 250 fois. Un même microscope peut recevoir différents objectifs qui sont, aujourd’hui, souvent corrigés à l’infini. Le choix se fait en fonction du mode d'observation, du grossissement, de l'ouverture numérique, de la distance frontale et aussi du prix.

LES OCULAIRES : Ils se montent sur le tube d'observation. C'est là que l'observateur place son oeil. Ils permettent l'exploitation de l'image par un grandissement de 5 à 15 fois le plus souvent. Ils se caractérisent aussi par leur indice de champ.

LE DIAPHRAGME DE CHAMP : Situé dans l’illuminateur (en épiscopie) ou à la base du statif (en diascopie) il permet de cerner le champ éclairé sur l ’échantillon.

LE DIAPHRAGME D'OUVERTURE : Situé sur l'illuminateur (en épiscopie) ou sur le condenseur (en diascopie). Son ajustement est lié à l'objectif utilisé, son rôle est majeur pour obtenir une bonne image. Il permet de compenser le manque de profondeur de champ de certains objectifs.

Les objectifs

Généralités

Pièce maîtresse d’un microscope, les objectifs en déterminent la qualité mais aussi le prix. Plusieur paramètres sont à prendre en compte :

1. On distingue deux types d'objectifs :
Les objectifs BIOLOGIQUE : Certains ont une optique corrigée pour travailler à travers une lamelle de 0,17 micron; leur ouverture numérique (O.N.) est supérieure à 0,4. D'autres ont une optique corrigée pour travailler à travers un récipient en verre ou en plastique.
Les objectifs METALLOGRAPHIQUE dont l'optique n'est pas corrigée.

2. Le grossissement est également un facteur à prendre en compte : ils sont généralement compris entre 0,5x (pour un stéréo microscope) et 100x (pour un microscope droit). Plus le grossissement est fort plus la distance entre l’objectif et la préparation est faible (voir ouverture numérique).

3. Sont également à prendre en compte les problèmes d'aberration chromatique et de planéité.
- On distingue les objectifs Achromatique qui offrent un correction sur 2 couleurs et les objectifs Apochromatiques qui sont, eux, corrigés sur 3 couleurs.
- Il existe des objectifs semi-plans dont la planéité s'étend sur 90% de leur surface et des objectifs plans avec une planéité sur 100% de leur surface.

4. Finalement, il faut bien comprendre le lien entre ouverture numérique (O.N.) et distance de travail (W.D. pour "Working Distance" en Anglais). Généralement, plus un objectif a une ouverture numérique (O.N.) élevée, plus sa distance de travail est faible (voir l’illustration ci-dessous)

ouverture numérique vs distance de travail

Grossissement et Grandissement

Il faut bien comprendre la différence entre grossissement et grandissement.

  • - Pour les microscopes rĂ©cents, le grossissement total est le produit du grossissement de l’objectif par celui de l’oculaire.
  • - Les oculaires ne servent qu’à grandir l’image mais n’apporte rien au pouvoir sĂ©parateur.
  • - En pratique un objectif est exploitable jusqu’à 1000 fois son ouverture numĂ©rique.
  • - Grossissement : J’augmente la taille de l’objet observĂ© et la finesse des dĂ©tails
  • - Grandissement : J’augmente uniquement la taille de l’objet observĂ©.

Pouvoir séparateur

Pouvoir séparateur

Il s'agit de la capacité à distinguer deux points distincts ou, plus exactement, la distance minimale distinguable entre deux points (voir dessin). Plus le pouvoir séparateur est petit, plus on pourra observer des détails fins.

La résolution dépend de l’ouverture numérique et de la longueur d’onde selon la formule suivante :
R . µ = 0,61 Ă— (λ / ON)
        ON = n . sin(u) (ouverture numĂ©rique, voir notion d’optique)
        λ = 0,55µm (longueur d'onde)

En fait elle dépend aussi du condenseur :
R = 1,22 Ă— λ / (ON_objectif + ON_condenseur)

Une solutions courrament utilisée pour améliorer le pouvoir séparateur consiste donc à utiliser un milieu séparant l'objectif de l'échantillon, tel que l'huile, dont l'indice de réfraction est plus élevé que celui de l'air(huile)



Profondeur de champ

C'est l'épaisseur de la préparation où l’image est nette.

Calcul de la profondeur de champ en utilisant la formule de BEREK :
d = [ W Ă— 250000 / ON Ă— M ] + [ λ / 2 Ă— (ON)² ]
        d = Profondeur de champ en micron
        w = Coefficient liĂ© au pouvoir de rĂ©solution de l’oeil humain (0,0014 est la valeur communĂ©ment admise)
        M = Grossissement total de l’image (Grossissement objectif multipliĂ© par grossissement oculaire)
        O N. = Ouverture numĂ©rique de l’objectif utilisĂ©
        λ = Longueur d’onde. (0,55µm.)

Lors d'une capture numérique la profondeur de champ est encore plus faible et seule la deuxième partie de la formule est conservée:
dNum = λ / 2x(ON)²


Exemples de profondeur de champs pour quelques objectifs

Parfocalité

Il s'agit de la capacité d'une gamme d'objectifs montés sur une même microscope à travailler avec la même distance de travail. Individuellement, on parle de la distance parfocale d'un objectif.

Pour une optique à 160mm : la parfocalité standard est de 45 mm (avec un pas de vis 20,32 mm)

Champ observé

Le champ observé se calcule en divisant l'indice de champ de l’oculaire (Ic, diamètre exprimé en mm) par le grossissement de l’objectif (Go).

Exemple : pour une oculaire "10x/20mm" (indice de champ = 20)
et un objectif de 100x :

Diamètre observé = Ic / Go = 20 / 100 = 0.2 mm
Champ observĂ© = Diamètre observĂ© Ă— Π = 0.2 Ă— Π = 0,62 mm²;



  • - Ex Oculaire 10X/20mm OBJECTIF 100X
  • - Diamètre observĂ© 20/100 = 0,2 mm (une binoculaire 21 / 1x0.62 = 33,9mm)
  • - NB Comme la surface d’un cercle est Ă©gale au carrĂ© du rayon par Pi p
  • - Oculaire 10/18 = 254 mm2
  • - Oculaire 10/22 = 380 mm2 (+50%)


Les modes d’observation

  • - LE FOND CLAIR : Le plus courant, Ă©clairage coaxial qui permet le contrĂ´le des motifs et restitue les couleurs.
  • - LA LUMIERE POLARISEE: Permet le contrĂ´le de la birĂ©fringence des substances.
  • - LE CONTRASTE DE PHASE : Il permet l'observation de coupes non colorĂ©es.
  • - LE FOND NOIR : Eclairage rasant. Il permet le contrĂ´le des contours.
  • - L'EPIFLUORESCENCE : Ce mode permet d'observer et de localiser dans la prĂ©paration des substances organiques qui fluorescent Ă  des longueurs d'ondes dĂ©finies.


Le fond clair (BF)

  • - Le plus courant
  • Droit
  • - Transmission/RĂ©flexion
  • InversĂ©
  • - Transmission/RĂ©flexion
  • Loupe
  • - Transmission/RĂ©flexion

Permet de visualiser un échantillon naturellement ou artificiellement coloré

Pour une bonne image
  • - RĂ©glage de Köhler (transmission)
  • - Mettre au point avec un objectif Ă  faible grossissement (10X)
  • - Fermer le diaphragme de champs (sur la statif)
  • - Modifier la hauteur du condenseur pour que l’image du diaphragme soit la plus petite et la plus net possible.
  • - Modifier latĂ©ralement le condenseur pour que l’image du diaphragme coĂŻncide avec le champ des oculaires.



  • - La cinquième opĂ©ration est de centrer son diaphragme de champ. (rĂ©glage de Köhler)
  • - En Ă©piscopie, il suffit d'utiliser les vis de rĂ©glage mais en diascopie, il faut d'abord rechercher la nettetĂ© de ce diaphragme. Il faut, pour cela, trouver la bonne position (en z) du condenseur avant de centrer ce dernier.
  • - Ensuite, on se positionne sur le plus faible des objectifs et on ouvre son diaphragme de champ jusqu'Ă  ne plus le voir.



Le diaphragme est net mais non correctement centré

La bonne position

En réflexion

On centre les diaphragmes de champ et d’ouverture


Du bon usage du diaphragme d’ouverture
  • - Diaphragme trop ouvert : image plate
  • - Diaphragme trop fermĂ© : trop de rĂ©fringence
  • - Le bon rĂ©glage : O N. condenseur = 80% O N. objectif

Effet de l'ouverture du condenseur sur la qualité de l'image



La polarisation

Usage général
  • - Droit transmission/rĂ©flexion
  • - InversĂ© : transmission/rĂ©flexion
  • - Loupe : transmission/rĂ©flexion
  • - But : visualiser et mesurer tous objets (structure cristalline) modifiant une lumière polarisĂ©e

Polarisation simplifiée

  • - Simple visualisation des cristaux par l’ajout d’un filtre Ă  un microscope en fond clair
  • - En transmission : un polarisateur avant le condenseur et un analyseur au dessus de l’objectif
  • - En rĂ©flexion : un filtre polarisant sur l’illuminateur avant le miroir et l’analyseur au dessus du miroir

Le microscope Polarisant

  • - Principales caractĂ©ristique
  • - Polariseur et analyseur tournant et graduĂ©s sur 360°
  • - Platine circulaire tournant graduĂ© sur 360° et orientable
  • - Optiques dĂ©tensionĂ©es (Pol)
  • - Objectifs centrables
  • - Fente pour compensateurs
  • - Lunette de Bertrand escamotable

Orthoscopie

  • - L’orthoscopie d’une lame mince de roche est utilisĂ©e pour examiner sa structure, les caractĂ©ristiques optiques de ces cristaux et identifier les minĂ©raux qui la composent.




Le contraste de phase (PH)

  • - Droit et InversĂ© uniquement en transmission
  • - Objectif : augmenter les contrastes d’objet peu ou pas colorĂ©.

Principe

On utilise les propriétés ondulatoires de la lumière.

  • 2 ondes en phase s’additionnent
  • 2 ondes en contraste de phase s’annulent
  • La lumière en traversant un objet va modifier son trajet optique et donc ĂŞtre en dĂ©phasage par rapport Ă  la lumière ayant traversĂ© le milieu.

Cellules vivantes en fond clair et en contraste de phase.


Matériel nécessaire

  • - Des objectifs Phase (notĂ©s PH)
  • - Des anneaux de phase correspondants aux objectifs utilisĂ©es dans un condenseur Ă  tourelle ou sur une barrette.
  • - Une lunette de centrage (facultative)

RĂ©glage des anneaux de phase

  • - Le rĂ©glage de Köhler a Ă©tĂ© effectuĂ©
  • - Pour chaque objectif PH
  • - Mettre l’anneau de phase du condenseur correspondant (mĂŞme numĂ©ros)
  • - Après avoir fait la mise au point sur la prĂ©paration, visualiser avec la lunette de centrage les 2 anneaux (sombre et clair) et centrer l’anneau du condenseur pour que des deux anneaux soient concentriques.
  • - RĂ©pĂ©ter l’opĂ©ration pour chaque objectif phase




La fluorescence (FL)

Microscope droit ou inversé uniquement en réflexion.
  • But visualiser des dĂ©tails d’une prĂ©paration ou mettre en Ă©vidence une catĂ©gorie d’objets.
  • Technique en pleine expansion.
  • Technique permettant la visualisation d’objets très fins.

Fluoro-chrome

Molécule ayant la propriété quand elle est excitée par une lumière de longueur d’onde adéquate d’émettre une lumière dans une longueur d’onde supérieure.
  • - On peut distinguer :
  • - Les fluoro-chromes naturels
  • - Les fluoro-chromes de synthèse.
  • - L’Immuno fluorescence

Principe d’un microscope à fluorescence
  • - On sĂ©lectionne une petite partie du spectre de la lumière Ă©mise par une lampe gĂ©nĂ©ralement Ă  vapeur de mercure grâce Ă  un filtre (filtre d’excitation)
  • - Cette lumière est rĂ©flĂ©chie vers l’objectif par un miroir particulier : le miroir dichroĂŻque
  • - La lumière Ă©mise par le fluo chrome traverse l’objectif puis le miroir vers les oculaires.
  • - Toutes lumières intempestives Ă©tant rejetĂ©es par un deuxième filtre (filtre d’émission)


  • - Filtre d’excitation : longueurs d’onde qu’il laisse passer
  • - Miroir dichroĂŻque : longueur d’onde Ă  partir de laquelle il ne rĂ©flĂ©chit plus la lumière.
  • - Filtre d’émission : longueur d’onde Ă  partir de laquelle il laisse passer la lumière.
  • - Attention : par exemple les utilisateurs parlent souvent de fluo bleu car ils voient fluorescer dans les bleus leur prĂ©paration.

Les objectifs FLUO

  • Les verres ordinaires filtrent les ultraviolets UV.
  • Les constructeurs ont dĂ©veloppĂ©s une gamme d’optique ayant une meilleure transmission dans les UV.
  • De plus ayant une ouverture numĂ©rique ON plus Ă©levĂ©e que des Plan classiques ils sont plus lumineux, intensitĂ© lumineuse : ON4/Grossissement2

Coupe végétale en fond clair et fluo



Fading

Un fluoro-chrome excité émet peu à peu moins de lumière

  • - Solution :
  • - diminuer l’intensitĂ© de l’excitation (filtres neutres)
  • - ou utiliser des agents anti-fading.

L’explosion des techniques

  • - Les techniques liĂ©es Ă  la fluorescence sont en pleine expansion
  • - Quelques exemples, combinaison de la Phase/Fluo








L’acquisition d’images

Depuis la révolution de la photo numérique, les techniques traditionnelles photo argentiques et polaroid sont en perte de vitesse.


Les notions de base

Le capteur est à la base de tout système d’imagerie numérique.

  • - PRINCIPE DE BASE : Un capteur peut ĂŞtre comparĂ© Ă  une grille matricielle composĂ©e de minuscules carrĂ©s sensibles Ă  la lumière qu’on appelle photo-site. Quand un photo-site est exposĂ© Ă  la lumière, il change de valeur Ă©lectrique. La grille complète est lue d’abord par ligne puis par colonne pour mĂ©moriser une image noir et blanc. Pour obtenir de la couleur il faut, au minimum, trois informations par « point image » (un rouge, un vert et un bleu). En fait, pour chaque pixel, il y a quatre photo-sites pour compenser le manque de sensibilitĂ© au vert du silicium. ConsĂ©quence : La nĂ©cessitĂ© d’une miniaturisation extrĂŞme.
  • - Un capteur de 5 mĂ©ga pixels supporte 20 millions de photo sites.
  • - DEUX TYPES DE CAPTEURS sont couramment utilisĂ©s : le CCD et le Cmos.
  • - Pour un usage gĂ©nĂ©ral ont utilise un seul capteur, mais pour un meilleur rendu des couleurs il existe des camĂ©ras 3 capteurs ou 3 passes.
  • - TAILLE DES CAPTEURS : Augmenter la taille des capteurs devrait permettre de gagner en dĂ©finition et en luminositĂ© mais cela n’a pas de sens Ă©conomique. Ces capteurs sont gravĂ©s sur des disques de silicium ultra pur qui subissent de longues et onĂ©reuses opĂ©rations. Au final il y a beaucoup de dĂ©chet avec un prix de revient est principalement liĂ© au nombre de capteurs obtenus sur une seule tranche. Des capteurs mesurant 24x36 mm (43mm) auraient un prix de vente trop fort et il faut se contenter de tailles beaucoup plus modestes. En pratique sont utilisĂ©s des capteurs de 1/3 pouce (diagonale utile: 5,5mm.), ½ pouce (diagonale utile : 6mm.) 2/3 pouce (diagonale utile : 11mm.), 1 pouce (diagonale utile: 16mm.) et 4/3 pouce (diagonale utile: 22,5mm.)
  • - BRUIT ELECTRONIQUE ET SENSIBILITE : Plus les capteurs sont minuscules, plus petits sont les photo-sites et ils reçoivent peu de lumière. Il faut donc amplifier le signal jusqu’à un certain seuil. Au delĂ  apparaĂ®t un bruit Ă©lectronique (comme pour le son) qui vient dĂ©tĂ©riorer l’image. Pour Ă©viter le bruit Ă©lectronique et augmenter la sensibilitĂ© d’un appareil photo ou d’une camĂ©ra numĂ©rique, il faut donc prendre un capteur plus grand, ne pas exiger une grande dĂ©finition et le refroidir. (les capteurs sont plus sensibles par basse tempĂ©rature.)
  • - NOMBRE DE PIXELS :
  • - Ce nombre va directement influencer la dĂ©finition de l’image. Il est donc important d’avoir un grand nombre de pixels mais la qualitĂ© des optiques utilisĂ©e, la taille des capteurs et la sophistication des circuits qui traitent les donnĂ©es participent autant au rĂ©sultat final. (codage couleur en 24 bits pour avoir un excellent rendu)
  • Codage couleur BIT
  • - Le codage des niveaux d’intensitĂ© de lumière n’est pas linĂ©aire mais par pallier.
  • - Par ex une camĂ©ra 2 bits ne restitue que 4 niveaux d’intensitĂ©.


REFROIDISSEMENT
  • - Les capteurs sont plus sensibles Ă  basse tempĂ©rature.
  • - L’électronique d’une camĂ©ra chauffe et cet Ă©chauffement provoque des sauts Ă©lectroniques qui provoquent des « faux photons »
  • - Sur des temps d’exposition long, ils s’additionnent Ă  l’image en accumulant du bruit de fond.
  • - On peut classer les camĂ©ras sur 3 niveaux.
  • - CamĂ©ra non refroidie pour usage gĂ©nĂ©ral.
  • - CamĂ©ra rafraĂ®chie pour faible luminositĂ©.
  • - Camera refroidie (T°inf. 3°) pour très faible luminositĂ©.

Une fois l’image obtenue, il reste à la transférer et à la stocker sur un ordinateur.

  • - COMMUNICATION :
    Aujourd’hui, sont principalement utilisées les prises USB2 et les ports « Firewire » (ou IEEE1394.)
    Dans les deux cas il s’agit d’un transfert à haut débit (environ 400Mb/s)
  • - STOCKAGE :
    De multiples « formats images » existent et les logiciels sérieux peuvent en lire un grand nombre.
    Les deux plus répandus sont le « TIF » et le « JPEG »
    Ce dernier a l’avantage de compresser les images et d’en réduire la taille mais des informations seront obligatoirement perdues. En microscopie, le format « TIF » sera préférable pour ne perdre aucun détail et conserver des informations complémentaires comme barre d’échelle, grandissement ou commentaires.


Choix d’une caméra ou d’un appareil photographique numérique pour équiper un microscope

Sur un microscope, ce choix va être principalement dicté par trois critères :

  • - 1° critère :
  • - La quantitĂ© de lumière disponible. Sur un microscope, elle dĂ©pend principalement du mode d’observation. En fond clair, pas de problème. Tous les appareils photo NumĂ©riques peuvent convenir mais dans le cas de la polarisation ou de la fluorescence, il faudra envisager une camĂ©ra numĂ©rique refroidie et possĂ©dant un capteur de grande taille.
  • - 2° critère :
  • - Champ photographiĂ© et grossissements dĂ©sirĂ©s.
  • - Comme en 24x36 le grandissement final dĂ©pend de quatre Ă©lĂ©ments qu’il faut absolument connaĂ®tre.
  • - Il s’agit du grossissement de l’objectif, des dimensions du capteur, du grandissement de l’adaptateur vidĂ©o et du moyen de reproduction (Ă©cran, imprimante, projecteur…)
  • - S’il est facile de connaĂ®tre les deux premiers Ă©lĂ©ments il est parfois plus dĂ©licat d’avoir des certitudes sur l’agrandissement de la sortie vidĂ©o car tous les microscopes bĂ©nĂ©ficient de nombreuses possibilitĂ©s (le tableau ci-après donne un aperçu des nombreuses sorties vidĂ©o possibles sur un seul modèle de microscope.)
  • - Le grossissement visible Ă  l'Ă©cran se dĂ©termine globalement comme suit, G = G objectif x G objectif supplĂ©mentaire (si installĂ©) x G adaptateur x (diagonale du moniteur / diagonale du capteur CCD ou CMOS)
  • - La seule mĂ©thode efficace est de projeter une lame micromĂ©trique Ă  l’écran.



3° critère :
  • - Le nombre de pixels nĂ©cessaire pour bĂ©nĂ©ficier pleinement de la rĂ©solution du microscope.
    Il va dépendre du grossissement, de la résolution de l’objectif, de la dimension du capteur et du grandissement du projectif vidéo.
  • - La formule est la suivante : NP=[1000 /(R x Go)] x Gv x Dc x 3
    NP= Nombre de pixels
    R= Résolution de l’objectif en micron
    Go= Grossissement de l’objectif
    Gv= Grandissement de la sortie vidéo
    Dc= Dimension du capteur en millimètres (longueur ou largeur.)
    3= Coefficient communément admis et qui correspond au nombre minimum de pixels pour visualiser une ligne.
TABLEAU RECAPITULATIF DU NOMBRE DE PIXELS NECESSAIRE POUR QUELQUES OBJECTIFS



Quelques remarques sur le nombre de pixels

  • 1/ Comme on vient de le voir les systèmes optiques ont des limites physiques
  • 2/ La taille des fichiers Ă  exporter et Ă  stocker sont proportionnels aux nombres de pixels
  • 3/ Les Ă©crans informatiques et les disques durs ont des limites physiques.
Quelques conseils pratiques pour une bonne acquisition

  • 1. D’abord avoir un microscope bien rĂ©glĂ© et des optiques propres.
  • 2. Deuxièmement utiliser les bons filtres
  • 3. Filtre lumière de jour, Ă©ventuellement filtre neutre.
  • 4. RĂ©gler correctement l’intensitĂ© de sa lampe (en gĂ©nĂ©rale 80% de l’intensitĂ© maximale)
  • 5. Comme nous l’avons vu au dĂ©but une lampe halogène Ă  son spectre qui varie suivant la tension exercĂ©e. Une des erreurs les plus classiques est de travailler en sous tension.



Balance des blancs
  • La première opĂ©ration avant toute acquisition d’une image est d’effectuer la balance des blancs.
  • Se positionner sur une partie blanche de la prĂ©paration et valider le blanc camĂ©ra.


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