Aide aux choix d'un Microscope

SOMMAIRE

• - La microscopie
• - La lumière
• - Les sources de lumière (en microscopie)
• - Réfraction
• - Les 3 types de microscopes
• - Structure d’un microscope
• - Choix de la structure
• - La terminologie
• - Ouverture numérique
• - Pouvoir séparateur
•  

• - Profondeur de champ
• - Les modes d’observations
• - Le fond clair
• - La polarisation
• - Le contraste de phase
• - La fluorescence
• - L’acquisition d’images
• - Les notions de base
• - Choix d’une caméra ou d’un appareil photographique pour équiper un microscope
•  

Les principes de la microscopie

Introduction

Les propriétés d'un faisceau de lumière émis par une source lumineuse naturelle ou artificielle sont modifiées lorsqu'il traverse un échantillon. Ces modifications contiennent des informations spécifiques et caractéristiques de l’échantillon. Les lentilles des objectifs intégrées au microscope permettent l'amplification et la transformation de ces informations en une image visible à l'oeil. Plusieurs paramètres, parmi lesquelles les propriétés des milieux traversés par la lumière et la qualité des lentilles, agissent alors et modifient la qualité de l’information que l’observateur va recevoir. Chaque fois que le rayon lumineux va changer de milieu ou traverser une lentille, il va subir des changements de direction, des pertes d’informations. La qualité de la source lumineuse et son origine sont également des paramètres importants en microscopie.

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La lumière

La lumière est un ensemble d’ondes électromagnétiques qui stimulent les cellules nerveuses (cônes et bâtonnets) de l’oeil. Notre oeil est plus sensible aux variations de la couleur qu’à celles de l’intensité.

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Les sources de lumières

Les sources de lumière courrament utilisées en microscopie sont les suivantes : le soleil, les lampes à incandescence, les lampes à arc, les diodes électroluminescentes (LEDs) et le laser.

Le Soleil

• - Notre référence naturelle
• - Température de couleur 5300 °K
• - Lumière filtrée par l’atmosphère terrestre
• - Spectre visible bleuté

Lampes à incandescence

• - Pour un usage général
• - Faible coût
• - Température 3600 °K
• - Le spectre visible dépend de la tension exercée aux bornes de la lampe.
• - Faible intensité dans les couleurs froides

Lampes à arc

• Usage :
•   - Fluorescence (mercure)
•   - Métallographie (xénon)
•   - Loupe binoculaire (néon)
•  
• Avantages :
•   - Intensité constante
•   - Forte concentration lumineuse
•  
• Inconvénients :
•   - Durée de vie limitée
•   - Prix élevé

Diodes électroluminescentes (LEDs)

Principalement employé pour l’éclairage sous objectif des stéréo microscopes

• - Avantage : longue durée de vie (100.000 H contre 1.000 H pour une lampe classique)
• - Faible consommation
• - Intensité constante

Comparaison des différentes sources

Comme on peut le constater sur le graphique de gauche, chaque source de lumière possède un spectre d'émission spécifique.

Cette donnée devra parfois être prise en compte lors du choix de la source lumineuse la plus adapté à l'application souhaitée. On peut ainsi constater qu’une lampe à incandescence donne une lumière jaune orangé alors que la LED tirera davantage vers le bleu.

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Les Lentilles

On appelle lentille tout milieu transparent limité par deux surfaces dont l’une au moins n’est pas plane. La lentille est définie géométriquement par les paramètres suivants : le rayon de courbure, l’axe principal, la section principale, le diamètre d’ouverture, la distance focale.

Réfraction

les lentilles transmettent la lumière par un phénomène appellé "réfraction" qui varie selon le milieu traversé et les différentes longueurs d'onde composant la lumière. Cela peut entrainer des distorsions plus ou moins grande au niveau de l'image transmise.

Les défauts les plus courants observés quand le rayon lumineux traverse une lentille :

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Les différents types de microscopes

Il en découle différentes combinaisons suivant l'usage auquel le microscope est destiné :

• Microscope droit en Biologie
• - Transmission : fond clair, fond noir, contraste de phase, polarisation
• - Réflexion : Fluorescence
•  
• Microscope droit en Industrie
• - Transmission : Fond clair, Polarisation
• - Réflexion : fond clair, fond noir, polarisation
•  
• Microscope Inversé Biologie
• - Transmission : fond clair, contraste de phase
• - Réflexion : Fluorescence
•  
• Microscope inversé Métallographie
• - Réflexion : fond clair fond noir Interférentiel
•  
• Stéréo microscope
• - Transmission : fond clair, polarisation
• - Réflexion : fond clair, polarisation

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Choisir la bonne structure

Le choix ne se fera ni en fonction des optiques (la plupart des objectifs se montent indifféremment sur les microscopes droits et les microscopes inversés) ni en fonction du mode d’observation. Ce sera en général la nature des échantillons à observer qui déterminera la structure mécanique du microscope.

LE MICROSCOPE DROIT :

On choisira ce type de microscope pour observer des échantillons relativement minces (moins de 50 mm) ou pour ceux qui demandent des déplacements de la platine supérieurs à 30 mm.

LE MICROSCOPE INVERSE (platine fixe)

On choisira ce type de microscope pour observer des échantillons de volume important (métallographie) ou bien quand l’échantillon est dans un récipient avec du liquide (culture cellulaire)

LE STEREO MICROSCOPE pour des faibles grossissements en stéréoscopie

Sur le plan économique, il faut également comprendre, qu’à équipement équivalent (même mode
d’observation et mêmes optiques) le microscope droit sera toujours plus économique à l’achat.

La terminologie

LE STATIF : C'est la pièce maîtresse, le support mécanique. Il supporte le système de mise au point et la platine il doit donc être d'une grande stabilité. De manière générale, il conditionne l'ergonomie générale de l'appareil.

LE BOITIER LAMPE : Il s'agit d'un sytème destiné à éclairer les échantillons à observer. Il doit être sécurisé tout en permettant un remplacement facile de la lampe. Il peut recevoir des lampes tungstène, halogène, xénon ou à vapeur de mercure.

LA PLATINE : C'est la partie qui va recevoir l'échantillon. Ses dimensions doivent être adaptées à celles des échantillons et elle doit être très résistante à l'abrasion. Sa mécanique doit être soignée et résistante car elle est toujours l'élément le plus sollicité du microscope. Elle peut être, parfois motorisée.

LA TOURELLE : Elle reçoit les objectifs. Sa capacité peut varier selon les modes d'observation. Dans certains cas elle peut être orientable et dans d'autres cas motorisée.

L'ILLUMINATEUR : Il permet d'amener la lumière sur l'échantillon et de réguler son intensité pour une observation dans les meilleures conditions possibles. Il comporte un ou deux diaphragmes.

LE CONDENSEUR : Comme l'illuminateur il sert à éclairer l'échantillon. Son rôle est de concentrer le flux lumineux. Son bon réglage est très important. Ses caractéristiques sont liées au mode d'observation (fond clair, fond noir, contraste de phase, etc....)

LE TUBE D'OBSERVATION : Fixe ou orientable, il est monoculaire, binoculaire ou trinoculaire (un oculaire par œil plus une troisième pour une caméra numérique). Il reçoit les oculaires et se caractérise par son indice de champ.

L'OBJECTIF : C'est l'élément le plus important pour le résultat final. Son rôle est de collecter un maximum de lumière à partir de l’objet et de former une image réelle de haute qualité. Il peut y avoir, de cinq à vingt lentilles dans un seul objectif. Son grossissement peut varier de 1,25 à 250 fois. Un même microscope peut recevoir différents objectifs qui sont, aujourd’hui, souvent corrigés à l’infini. Le choix se fait en fonction du mode d'observation, du grossissement, de l'ouverture numérique, de la distance frontale et aussi du prix.

LES OCULAIRES : Ils se montent sur le tube d'observation. C'est là que l'observateur place son oeil. Ils permettent l'exploitation de l'image par un grandissement de 5 à 15 fois le plus souvent. Ils se caractérisent aussi par leur indice de champ.

LE DIAPHRAGME DE CHAMP : Situé dans l’illuminateur (en épiscopie) ou à la base du statif (en diascopie) il permet de cerner le champ éclairé sur l ’échantillon.

LE DIAPHRAGME D'OUVERTURE : Situé sur l'illuminateur (en épiscopie) ou sur le condenseur (en diascopie). Son ajustement est lié à l'objectif utilisé, son rôle est majeur pour obtenir une bonne image. Il permet de compenser le manque de profondeur de champ de certains objectifs.

Les objectifs

Généralités

Pièce maîtresse d’un microscope, les objectifs en déterminent la qualité mais aussi le prix. Plusieur paramètres sont à prendre en compte :

1. On distingue deux types d'objectifs :
Les objectifs BIOLOGIQUE : Certains ont une optique corrigée pour travailler à travers une lamelle de 0,17 micron; leur ouverture numérique (O.N.) est supérieure à 0,4. D'autres ont une optique corrigée pour travailler à travers un récipient en verre ou en plastique.
Les objectifs METALLOGRAPHIQUE dont l'optique n'est pas corrigée.

2. Le grossissement est également un facteur à prendre en compte : ils sont généralement compris entre 0,5x (pour un stéréo microscope) et 100x (pour un microscope droit). Plus le grossissement est fort plus la distance entre l’objectif et la préparation est faible (voir ouverture numérique).

3. Sont également à prendre en compte les problèmes d'aberration chromatique et de planéité.
- On distingue les objectifs Achromatique qui offrent un correction sur 2 couleurs et les objectifs Apochromatiques qui sont, eux, corrigés sur 3 couleurs.
- Il existe des objectifs semi-plans dont la planéité s'étend sur 90% de leur surface et des objectifs plans avec une planéité sur 100% de leur surface.

4. Finalement, il faut bien comprendre le lien entre ouverture numérique (O.N.) et distance de travail (W.D. pour "Working Distance" en Anglais). Généralement, plus un objectif a une ouverture numérique (O.N.) élevée, plus sa distance de travail est faible (voir l’illustration ci-dessous)

Grossissement et Grandissement

Il faut bien comprendre la différence entre grossissement et grandissement.

• - Pour les microscopes récents, le grossissement total est le produit du grossissement de l’objectif par celui de l’oculaire.
• - Les oculaires ne servent qu’à grandir l’image mais n’apporte rien au pouvoir séparateur.
• - En pratique un objectif est exploitable jusqu’à 1000 fois son ouverture numérique.
• - Grossissement : J’augmente la taille de l’objet observé et la finesse des détails
• - Grandissement : J’augmente uniquement la taille de l’objet observé.

Pouvoir séparateur

Il s'agit de la capacité à distinguer deux points distincts ou, plus exactement, la distance minimale distinguable entre deux points (voir dessin). Plus le pouvoir séparateur est petit, plus on pourra observer des détails fins.

La résolution dépend de l’ouverture numérique et de la longueur d’onde selon la formule suivante :
R . µ = 0,61 × (λ / ON)
        ON = n . sin(u) (ouverture numérique, voir notion d’optique)
        λ = 0,55µm (longueur d'onde)

En fait elle dépend aussi du condenseur :
R = 1,22 × λ / (ON_objectif + ON_condenseur)

Une solutions courrament utilisée pour améliorer le pouvoir séparateur consiste donc à utiliser un milieu séparant l'objectif de l'échantillon, tel que l'huile, dont l'indice de réfraction est plus élevé que celui de l'air(huile)

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Profondeur de champ

C'est l'épaisseur de la préparation où l’image est nette.

Calcul de la profondeur de champ en utilisant la formule de BEREK :
d = [ W × 250000 / ON × M ] + [ λ / 2 × (ON)² ]
        d = Profondeur de champ en micron
        w = Coefficient lié au pouvoir de résolution de l’oeil humain (0,0014 est la valeur communément admise)
        M = Grossissement total de l’image (Grossissement objectif multiplié par grossissement oculaire)
        O N. = Ouverture numérique de l’objectif utilisé
        λ = Longueur d’onde. (0,55µm.)

Lors d'une capture numérique la profondeur de champ est encore plus faible et seule la deuxième partie de la formule est conservée:
dNum = λ / 2x(ON)²

Parfocalité

Il s'agit de la capacité d'une gamme d'objectifs montés sur une même microscope à travailler avec la même distance de travail. Individuellement, on parle de la distance parfocale d'un objectif.

Pour une optique à 160mm : la parfocalité standard est de 45 mm (avec un pas de vis 20,32 mm)

Champ observé

Le champ observé se calcule en divisant l'indice de champ de l’oculaire (Ic, diamètre exprimé en mm) par le grossissement de l’objectif (Go).

Exemple : pour une oculaire "10x/20mm" (indice de champ = 20)
et un objectif de 100x :

Diamètre observé = Ic / Go = 20 / 100 = 0.2 mm
Champ observé = Diamètre observé × Π = 0.2 × Π = 0,62 mm²;

• - Ex Oculaire 10X/20mm OBJECTIF 100X
• - Diamètre observé 20/100 = 0,2 mm (une binoculaire 21 / 1x0.62 = 33,9mm)
• - NB Comme la surface d’un cercle est égale au carré du rayon par Pi p
• - Oculaire 10/18 = 254 mm2
• - Oculaire 10/22 = 380 mm2 (+50%)

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Les modes d’observation

• - LE FOND CLAIR : Le plus courant, éclairage coaxial qui permet le contrôle des motifs et restitue les couleurs.
• - LA LUMIERE POLARISEE: Permet le contrôle de la biréfringence des substances.
• - LE CONTRASTE DE PHASE : Il permet l'observation de coupes non colorées.
• - LE FOND NOIR : Eclairage rasant. Il permet le contrôle des contours.
• - L'EPIFLUORESCENCE : Ce mode permet d'observer et de localiser dans la préparation des substances organiques qui fluorescent à des longueurs d'ondes définies.

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Le fond clair (BF)

• - Le plus courant
• Droit
• - Transmission/Réflexion
• Inversé
• - Transmission/Réflexion
• Loupe
• - Transmission/Réflexion

Permet de visualiser un échantillon naturellement ou artificiellement coloré

Pour une bonne image

• - Réglage de Köhler (transmission)
• - Mettre au point avec un objectif à faible grossissement (10X)
• - Fermer le diaphragme de champs (sur la statif)
• - Modifier la hauteur du condenseur pour que l’image du diaphragme soit la plus petite et la plus net possible.
• - Modifier latéralement le condenseur pour que l’image du diaphragme coïncide avec le champ des oculaires.

• - La cinquième opération est de centrer son diaphragme de champ. (réglage de Köhler)
• - En épiscopie, il suffit d'utiliser les vis de réglage mais en diascopie, il faut d'abord rechercher la netteté de ce diaphragme. Il faut, pour cela, trouver la bonne position (en z) du condenseur avant de centrer ce dernier.
• - Ensuite, on se positionne sur le plus faible des objectifs et on ouvre son diaphragme de champ jusqu'à ne plus le voir.

Le diaphragme est net mais non correctement centré

La bonne position

En réflexion

On centre les diaphragmes de champ et d’ouverture


Du bon usage du diaphragme d’ouverture

• - Diaphragme trop ouvert : image plate
• - Diaphragme trop fermé : trop de réfringence
• - Le bon réglage : O N. condenseur = 80% O N. objectif

Effet de l'ouverture du condenseur sur la qualité de l'image

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La polarisation

Usage général

• - Droit transmission/réflexion
• - Inversé : transmission/réflexion
• - Loupe : transmission/réflexion
• - But : visualiser et mesurer tous objets (structure cristalline) modifiant une lumière polarisée

Polarisation simplifiée

• - Simple visualisation des cristaux par l’ajout d’un filtre à un microscope en fond clair
• - En transmission : un polarisateur avant le condenseur et un analyseur au dessus de l’objectif
• - En réflexion : un filtre polarisant sur l’illuminateur avant le miroir et l’analyseur au dessus du miroir

Le microscope Polarisant

• - Principales caractéristique
• - Polariseur et analyseur tournant et gradués sur 360°
• - Platine circulaire tournant gradué sur 360° et orientable
• - Optiques détensionées (Pol)
• - Objectifs centrables
• - Fente pour compensateurs
• - Lunette de Bertrand escamotable

Orthoscopie

• - L’orthoscopie d’une lame mince de roche est utilisée pour examiner sa structure, les caractéristiques optiques de ces cristaux et identifier les minéraux qui la composent.

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Le contraste de phase (PH)

• - Droit et Inversé uniquement en transmission
• - Objectif : augmenter les contrastes d’objet peu ou pas coloré.

Principe

On utilise les propriétés ondulatoires de la lumière.

• 2 ondes en phase s’additionnent
• 2 ondes en contraste de phase s’annulent
• La lumière en traversant un objet va modifier son trajet optique et donc être en déphasage par rapport à la lumière ayant traversé le milieu.

Cellules vivantes en fond clair et en contraste de phase.


Matériel nécessaire

• - Des objectifs Phase (notés PH)
• - Des anneaux de phase correspondants aux objectifs utilisées dans un condenseur à tourelle ou sur une barrette.
• - Une lunette de centrage (facultative)

Réglage des anneaux de phase

• - Le réglage de Köhler a été effectué
• - Pour chaque objectif PH
• - Mettre l’anneau de phase du condenseur correspondant (même numéros)
• - Après avoir fait la mise au point sur la préparation, visualiser avec la lunette de centrage les 2 anneaux (sombre et clair) et centrer l’anneau du condenseur pour que des deux anneaux soient concentriques.
• - Répéter l’opération pour chaque objectif phase

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La fluorescence (FL)

Microscope droit ou inversé uniquement en réflexion.

• But visualiser des détails d’une préparation ou mettre en évidence une catégorie d’objets.
• Technique en pleine expansion.
• Technique permettant la visualisation d’objets très fins.

Fluoro-chrome

Molécule ayant la propriété quand elle est excitée par une lumière de longueur d’onde adéquate d’émettre une lumière dans une longueur d’onde supérieure.

• - On peut distinguer :
• - Les fluoro-chromes naturels
• - Les fluoro-chromes de synthèse.
• - L’Immuno fluorescence

Principe d’un microscope à fluorescence

• - On sélectionne une petite partie du spectre de la lumière émise par une lampe généralement à vapeur de mercure grâce à un filtre (filtre d’excitation)
• - Cette lumière est réfléchie vers l’objectif par un miroir particulier : le miroir dichroïque
• - La lumière émise par le fluo chrome traverse l’objectif puis le miroir vers les oculaires.
• - Toutes lumières intempestives étant rejetées par un deuxième filtre (filtre d’émission)

• - Filtre d’excitation : longueurs d’onde qu’il laisse passer
• - Miroir dichroïque : longueur d’onde à partir de laquelle il ne réfléchit plus la lumière.
• - Filtre d’émission : longueur d’onde à partir de laquelle il laisse passer la lumière.
• - Attention : par exemple les utilisateurs parlent souvent de fluo bleu car ils voient fluorescer dans les bleus leur préparation.

Les objectifs FLUO

• Les verres ordinaires filtrent les ultraviolets UV.
• Les constructeurs ont développés une gamme d’optique ayant une meilleure transmission dans les UV.
• De plus ayant une ouverture numérique ON plus élevée que des Plan classiques ils sont plus lumineux, intensité lumineuse : ON4/Grossissement2

Coupe végétale en fond clair et fluo



Fading

Un fluoro-chrome excité émet peu à peu moins de lumière

• - Solution :
• - diminuer l’intensité de l’excitation (filtres neutres)
• - ou utiliser des agents anti-fading.

L’explosion des techniques

• - Les techniques liées à la fluorescence sont en pleine expansion
• - Quelques exemples, combinaison de la Phase/Fluo

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L’acquisition d’images

Depuis la révolution de la photo numérique, les techniques traditionnelles photo argentiques et polaroid sont en perte de vitesse.

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Les notions de base

Le capteur est à la base de tout système d’imagerie numérique.

• - PRINCIPE DE BASE : Un capteur peut être comparé à une grille matricielle composée de minuscules carrés sensibles à la lumière qu’on appelle photo-site. Quand un photo-site est exposé à la lumière, il change de valeur électrique. La grille complète est lue d’abord par ligne puis par colonne pour mémoriser une image noir et blanc. Pour obtenir de la couleur il faut, au minimum, trois informations par « point image » (un rouge, un vert et un bleu). En fait, pour chaque pixel, il y a quatre photo-sites pour compenser le manque de sensibilité au vert du silicium. Conséquence : La nécessité d’une miniaturisation extrême.
• - Un capteur de 5 méga pixels supporte 20 millions de photo sites.
• - DEUX TYPES DE CAPTEURS sont couramment utilisés : le CCD et le Cmos.
• - Pour un usage général ont utilise un seul capteur, mais pour un meilleur rendu des couleurs il existe des caméras 3 capteurs ou 3 passes.
• - TAILLE DES CAPTEURS : Augmenter la taille des capteurs devrait permettre de gagner en définition et en luminosité mais cela n’a pas de sens économique. Ces capteurs sont gravés sur des disques de silicium ultra pur qui subissent de longues et onéreuses opérations. Au final il y a beaucoup de déchet avec un prix de revient est principalement lié au nombre de capteurs obtenus sur une seule tranche. Des capteurs mesurant 24x36 mm (43mm) auraient un prix de vente trop fort et il faut se contenter de tailles beaucoup plus modestes. En pratique sont utilisés des capteurs de 1/3 pouce (diagonale utile: 5,5mm.), ½ pouce (diagonale utile : 6mm.) 2/3 pouce (diagonale utile : 11mm.), 1 pouce (diagonale utile: 16mm.) et 4/3 pouce (diagonale utile: 22,5mm.)
• - BRUIT ELECTRONIQUE ET SENSIBILITE : Plus les capteurs sont minuscules, plus petits sont les photo-sites et ils reçoivent peu de lumière. Il faut donc amplifier le signal jusqu’à un certain seuil. Au delà apparaît un bruit électronique (comme pour le son) qui vient détériorer l’image. Pour éviter le bruit électronique et augmenter la sensibilité d’un appareil photo ou d’une caméra numérique, il faut donc prendre un capteur plus grand, ne pas exiger une grande définition et le refroidir. (les capteurs sont plus sensibles par basse température.)
• - NOMBRE DE PIXELS :
• - Ce nombre va directement influencer la définition de l’image. Il est donc important d’avoir un grand nombre de pixels mais la qualité des optiques utilisée, la taille des capteurs et la sophistication des circuits qui traitent les données participent autant au résultat final. (codage couleur en 24 bits pour avoir un excellent rendu)
Codage couleur BIT

• - Le codage des niveaux d’intensité de lumière n’est pas linéaire mais par pallier.
• - Par ex une caméra 2 bits ne restitue que 4 niveaux d’intensité.

REFROIDISSEMENT

• - Les capteurs sont plus sensibles à basse température.
• - L’électronique d’une caméra chauffe et cet échauffement provoque des sauts électroniques qui provoquent des « faux photons »
• - Sur des temps d’exposition long, ils s’additionnent à l’image en accumulant du bruit de fond.
• - On peut classer les caméras sur 3 niveaux.
• - Caméra non refroidie pour usage général.
• - Caméra rafraîchie pour faible luminosité.
• - Camera refroidie (T°inf. 3°) pour très faible luminosité.

Une fois l’image obtenue, il reste à la transférer et à la stocker sur un ordinateur.

• - COMMUNICATION :
  Aujourd’hui, sont principalement utilisées les prises USB2 et les ports « Firewire » (ou IEEE1394.)
  Dans les deux cas il s’agit d’un transfert à haut débit (environ 400Mb/s)
• - STOCKAGE :
  De multiples « formats images » existent et les logiciels sérieux peuvent en lire un grand nombre.
  Les deux plus répandus sont le « TIF » et le « JPEG »
  Ce dernier a l’avantage de compresser les images et d’en réduire la taille mais des informations seront obligatoirement perdues. En microscopie, le format « TIF » sera préférable pour ne perdre aucun détail et conserver des informations complémentaires comme barre d’échelle, grandissement ou commentaires.

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Choix d’une caméra ou d’un appareil photographique numérique pour équiper un microscope

Sur un microscope, ce choix va être principalement dicté par trois critères :

• - 1° critère :
• - La quantité de lumière disponible. Sur un microscope, elle dépend principalement du mode d’observation. En fond clair, pas de problème. Tous les appareils photo Numériques peuvent convenir mais dans le cas de la polarisation ou de la fluorescence, il faudra envisager une caméra numérique refroidie et possédant un capteur de grande taille.
• - 2° critère :
• - Champ photographié et grossissements désirés.
• - Comme en 24x36 le grandissement final dépend de quatre éléments qu’il faut absolument connaître.
• - Il s’agit du grossissement de l’objectif, des dimensions du capteur, du grandissement de l’adaptateur vidéo et du moyen de reproduction (écran, imprimante, projecteur…)
• - S’il est facile de connaître les deux premiers éléments il est parfois plus délicat d’avoir des certitudes sur l’agrandissement de la sortie vidéo car tous les microscopes bénéficient de nombreuses possibilités (le tableau ci-après donne un aperçu des nombreuses sorties vidéo possibles sur un seul modèle de microscope.)
• - Le grossissement visible à l'écran se détermine globalement comme suit, G = G objectif x G objectif supplémentaire (si installé) x G adaptateur x (diagonale du moniteur / diagonale du capteur CCD ou CMOS)
• - La seule méthode efficace est de projeter une lame micrométrique à l’écran.

3° critère :

• - Le nombre de pixels nécessaire pour bénéficier pleinement de la résolution du microscope.
  Il va dépendre du grossissement, de la résolution de l’objectif, de la dimension du capteur et du grandissement du projectif vidéo.
• - La formule est la suivante : NP=[1000 /(R x Go)] x Gv x Dc x 3
  NP= Nombre de pixels
  R= Résolution de l’objectif en micron
  Go= Grossissement de l’objectif
  Gv= Grandissement de la sortie vidéo
  Dc= Dimension du capteur en millimètres (longueur ou largeur.)
  3= Coefficient communément admis et qui correspond au nombre minimum de pixels pour visualiser une ligne.

TABLEAU RECAPITULATIF DU NOMBRE DE PIXELS NECESSAIRE POUR QUELQUES OBJECTIFS



Quelques remarques sur le nombre de pixels

• 1/ Comme on vient de le voir les systèmes optiques ont des limites physiques
• 2/ La taille des fichiers à exporter et à stocker sont proportionnels aux nombres de pixels
• 3/ Les écrans informatiques et les disques durs ont des limites physiques.

Quelques conseils pratiques pour une bonne acquisition

• 1. D’abord avoir un microscope bien réglé et des optiques propres.
• 2. Deuxièmement utiliser les bons filtres
• 3. Filtre lumière de jour, éventuellement filtre neutre.
• 4. Régler correctement l’intensité de sa lampe (en générale 80% de l’intensité maximale)
• 5. Comme nous l’avons vu au début une lampe halogène à son spectre qui varie suivant la tension exercée. Une des erreurs les plus classiques est de travailler en sous tension.

Balance des blancs

• La première opération avant toute acquisition d’une image est d’effectuer la balance des blancs.
• Se positionner sur une partie blanche de la préparation et valider le blanc caméra.